Einfache Methode zur Fluoreszenzmikroskopie mit verbesserter Auflösung in allen drei Raumrichtungen

Die Arbeitsgruppe Angewandte Laserphysik & Laserspektroskopie unter der Leitung von Professor Dr. Markus Sauer (Fakultät für Physik der Universität Bielefeld) hat ein neues sehr einfaches Verfahren entwickelt, mit dem es möglich ist, biologische Strukturen in Zellen mit circa zweifach besserer Auflösung in allen drei Raumrichtungen abzubilden.

Unter Verwendung eines Standard Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskops (LSM), wie es in den Lebenswissenschaften weit verbreitet ist, kann so erstmals für Jedermann zugänglich auf einfache Art und Weise eine Auflösung von circa 130 Nanometer (nm) in zweidimensionaler („lateraler“) und 350 nm in räumlicher („axialer“) Richtung erreicht werden.

Optische Verfahren wie die Fluoreszenzmikroskopie sind ideal zur bildgebenden Beobachtung von Zellen und Gewebe geeignet, da sie es ermöglichen nicht-invasiv dreidimensionale Bilder aufzunehmen. Leider ist der optischen Mikroskopie aufgrund des Wellencharakters des Lichts und der damit verbundenen Beugung eine Auflösungsgrenze von circa der halben Wellen-länge gesetzt.

Das heißt, es ist mit gewöhnlichen lichtmikroskopischen Verfahren nicht möglich, Strukturinformation unterhalb von circa 250 nm in lateraler und circa 600-700 nm in axialer Richtung zu erhalten. Zur Verbesserung der beugungsbedingten Auflösungsgrenze wurden kürzlich neue Methoden wie die STED-Mikroskopie und die Lokalisationsmikroskopie auf Einzelmolekülebene (STORM, dSTORM, PALM) entwickelt, die routinemäßig eine Auflösung von besser als 50 nm in lateraler Richtung versprechen.

Andererseits muss hierfür ein erheblicher technischer Aufwand durch Überlagerung von verschiedenen Laserlinien oder einzelmolekülempfindliche Detektionsverfahren eingesetzt werden, die zusätzlich aufgrund der Strahlungsbelastung nur beschränkt für die Lebendzellmikroskopie eingesetzt werden können.

Es gab aber auch schon früh die Idee, Mehrphotonenanregungsprozesse zur Auflösungserhöhung zu verwenden. Während die Mehrphotonenanregungs-Mikroskopie wesentliche Vorteile beim „Sectioning“, der Aufteilung in verschiedene Bildebenen, in axialer Richtung besitzt, wird die Auflösungserhöhung in lateraler Richtung aber durch die längere Anregungswellenlänge kompensiert. Den Forschern um Professor Markus Sauer ist es nun gelungen, Mehrphotonenprozesse in „lumineszierenden“ (= leuchtenden) Halbleiterkügelchen, so genannten Quantenpunkten, zur Auflösungserhöhung in allen drei Raumrichtungen in einem Standardmikroskop einzusetzen und damit eine circa zweifach bessere optische Auflösung selbst in lebenden Zellen zu demonstrieren. Hierzu benutzen die Forscher ein Standard Laser-Scanning-Mikroskop. Zur Anregung wird ein einfacher Ar-Ionen-Laser benutzt.

Der Trick liegt darin, dass in manchen Quantenpunkten in Abhängigkeit von ihrem Material und der Größe drei Excitonen (strahlende Elektronen-Loch-Paare), ein so genanntes Triexciton, durch die Absorption von drei Photonen entstehen kann, das bei einer kürzeren Wellenlänge als die herkömmliche Lumineszenz der Quantenpunkte (Mono- und Biexciton) Licht emittiert. Das heißt, die Forscher detektierten die Emission der Probe einfach bei einer kürzeren Wellen-länge und erzielten so eine Auflösungserhöhung um den Faktor ?3 entsprechend einem Drei-Photonen-Prozess in allen drei Raumrichtungen. Die hier zusammengefassten Ergebnisse wurden im Fachjournal „Nano Letters“ (Hennig et al., Nano Lett. 2009, 9, 2466-2470) veröffentlicht.

Der Charme des Verfahrens liegt darin, dass es jedem Forscher mit handelsüblichem Fluoreszenzmikroskop möglich ist, nun eine bessere Auflösung in allen drei Raumrichtungen auch in lebenden Zellen und Gewebe zu realisieren und – das nur durch die Verwendung von Quantenpunkten als effiziente Marker und der Detektion des Signals bei einer kürzeren Wellenlänge.

Kontakt:

Prof. Dr. Markus Sauer, Universität Bielefeld
Fakultät für Physik
Tel.: 0521/106-5451
E-Mail: sauer@physik.uni-bielefeld.de