Trinukleotidsynthos

Einleitung

Im letzten Jahrzehnt hat das Interesse an effizienten Methoden für die gezielte Mutagenese stark zugenommen. Dabei stehen die Funktionsoptimierung von Proteinen und Peptiden sowie das De-sign neuer Enzyme im Vordergrund. Enzyme führen in unterschiedlichen industriellen Produktionsprozessen die Synthese von hochreinen chemischen Substanzen durch. Ihre Leistungsfähigkeit ist im Bezug auf die Effizienz besonders hoch und lässt sich mit Hilfe der Modifikation des genetischen Codes noch entscheidend verbessern.

Problemstellung

Durch die Verwendung von synthetisch hergestellten Oligonukleotiden werden an ausgewählten Orten der Proteinsequenz Variationen der 20 Aminosäuren generiert. Werden üblicherweise gemischte Oligonukleotide durch statistische Kopplung einer Nukleotidmischung in jedem Zyklus der automatisierten Festphasensynthese erzeugt, so ist es unmöglich, die Einbringung unerwünschter Aminosäuren oder gar die Erzeugung von Stop-Codons zu vermeiden. Auf diese Weise ist es unmöglich, nur eine bestimmte Auswahl von Codons an einer definierten Position zu generieren. Weiterhin ist die Häufigkeit der mit dieser Methode erzeugten Mutanten hin zu den Aminosäuren, welche von redundanten Codons kodiert werden, verzerrt. Trinukleotid-Synthons werden als besser geeignete Synthesebausteine für die Generierung von kontrolliert gemischten Oligonukleotiden angesehen.

Innovation

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Trinukleotidphosphoramidite leicht zugänglich. Diese können mittels Festphasen-Phosphoramidit-Methode Kopplungsreaktionen eingehen. Durch die verwendete Schutzgruppenstrategie erlauben sie das Entschützen der synthetisierten Oligonukleotide und die Abspaltung von Trägermaterial in einem Schritt.

Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet den Ansatz, welcher auf DMT als 5’-Schutzgruppe und einer tert-Butyldimethylsilyl-Gruppe (TBDMS) oder einer Disulfid-Gruppe als 3’-Schutzgruppe beruht. Dies wird mit einer geeigneten Schutzgruppe am Phosphat, vorzugsweise einer β -Cyanoethylgruppe kombiniert. Erfindungsgemäß erfolgt eine Freisetzung der 3’-OH-Gruppe durch Abspaltung der 3’-TBDMS-Gruppe mit einem fluoridhaltigen Reagenz in einem polaren aprotischen Lösungsmittel, vorzugsweise TEA/3HF in DMF. Für die Beendigung der Reaktion wird eine wässrige Lösung einer wasserlöslichen Base verwendet. Es wurden Trinukleotidphosphoramidite hergestellt, welche Codons aller 20 Aminosäuren repräsentieren.

Nutzen
• einfach
• schnell
• kosteneffizient
• kontrollierte Generierung von Codons
Fachbereich:
Chemie
Gentechnik
Stand Entwicklung:
Stand Schutzrecht:
Patent (DE) eingereicht.
Internationale Nachanmeldung möglich.
Angebot:
Lizenzvertrag
Patentverkauf
Entwicklungskooperation
© PVA-MV AG, 2009
Kontakt:
Tobias Parikh
PVA-MV AG
Gerhart-Hauptmann-Str. 23
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Fax +49-381-49 74 74-9
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