Neue Methode vereinfacht genetische Modifikationen

Um genetische Modifikationen auszulösen, verändern Forscher gezielt einen bestimmten Abschnitt des Erbgutes in embryonalen Stammzellen von Mäusen. Bei den herkömmlichen Techniken des Einführens eines modifizierten Abschnitts von DNS wird die veränderte Erbinformation allerdings nur sehr selten durch eine homologe Rekombination an der richtigen Stelle in das Erbgut der Wirtszelle eingebaut.

Neuere Verfahren wie das RMCE-Kassettenaustauschverfahren können modifizierte Gene wesentlich effizienter ins Erbgut von Säugerzellen einbringen. Allerdings müssen zuvor bestimmte, sogenannte heterotypische Erkennungssequenzen mithilfe der homologen Rekombination in das Zielgenom eingebracht werden. Diese markieren den Ort, an dem danach das massgeschneiderte Stück DNS eingefügt werden soll. Dieses Verfahren lässt sich aber nur in speziellen Fällen anwenden und insbesondere die vielen bereits modifizierten Mäusegene, bei denen sich Mutationen dank konditioneller Allele flexibel auslösen lassen, sind für dieses Austauschverfahren nicht geeignet.

Doppeltes Austauschverfahren
Forschern um Prof. Rolf Zeller vom Department Biomedizin der Universität Basel ist es nun gelungen, ohne die Hilfe der heterotypischen Erkennungssequenzen genetische Konstrukte ins Genom zu integrieren. Die als «Dual-RMCE» bezeichnete Technologie macht sich dabei mit FRT und LoxP zwei Erkennungssequenzen zunutze, die in den Tausenden von bereits vorhandenen konditionellen Allelen in Stammzellen von Mäusen vorhanden sind.

Mit diesem doppelten Austauschverfahren wird zunächst eine bestimmte Sequenz entfernt, um eine Andockstelle für den Vektor («Genfähre») zu schaffen, der im darauffolgenden Schritt das Konstrukt in die Erbinformation einschleust. Damit lassen sich alle diese Allele ohne erneute homologe Rekombination modifizieren. Zudem wird mit der neuen Methode die Frequenz drastisch gesteigert, mit der die neue Information korrekt in das Genom integriert wird.

Präzise Modifikationen
Die Dual-RMCE-Technologie erleichtert die präzise genetische Veränderung von embryonalen Stammzellen bei Mäusen, aus denen dann zum Beispiel durch in-vitro Differenzierung bestimmte Zelltypen gewonnen werden können. Diese Anwendungen sind für die Analyse der molekularen Grundlagen von Gewebedifferenzierung aus Stammzellen (Tissue Engineering) von grosser Bedeutung.

Mit dem Verfahren lassen sich aber auch krankheitserzeugende Mutationen in embryonale Stammzellen einführen und präzise Mausmodelle für menschliche Erkrankungen schaffen – zum Beispiel für die Erforschung von Tumoren oder degenerative Erkrankungen.

Schliesslich können Forscher mit der Dual-RMCE-Methode auch Proteine markieren, was es erlaubt, ihre Interaktionen und Funktionen im lebenden Organismus zu studieren – und dies viel genauer und mit weniger Aufwand als bisher.

Zum Patent angemeldet
Die von den Basler Forschern entwickelte Technologie hat grosses Potential sowohl für die Grundlagen- als auch für die angewandte Forschung. Deshalb hat die Universität Basel die Dual-RMCE-Technologie zum Patent angemeldet.
Originalbeitrag
Marco Osterwalder, Antonella Galli, Barry Rosen, William C Skarnes, Rolf Zeller & Javier Lopez-Rios
Dual RMCE for efficient re-engineering of mouse mutant alleles
Nature Methods, Published online 17 October 2010 | doi: 10.1038/nmeth.1521
Weitere Auskünfte
Prof. Rolf Zeller, Entwicklungsgenetik, Department Biomedizin der Universität Basel, Mattenstrasse 28, 4058 Basel. Tel +41 (0)61 695 30 33 (direkt) / + 41 (0)61 695 30 31 (Sekretariat), E-Mail: rolf.zeller@unibas.ch