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Mehr Details im Nanokosmos der Zelle

10.08.2006
Max-Planck-Forscher verbessern die Auflösung von Fluoreszenzmikroskopen deutlich

Wissenschaftler des Max-Planck-Instituts für Biophysikalische Chemie in Göttingen haben das Tor zum Nanokosmos der Zelle weiter aufgestoßen: Die Forscher haben die Auflösung von STED-Mikroskopen (Stimulated Emission Depletion) in Zellen erstmals auf bis zu 15 Nanometer verbessert. Erst im April hatten sie mit den Mikroskopen, deren Prinzip sie vor wenigen Jahren entwickelten, eine Detailschärfe von 60 Nanometern erreicht. Die Wissenschaftler können nun noch mehr Details als bislang aus dem Inneren einer Zelle abbilden, weil sie den effektiven Fokus des STED-Mikroskops weiter verkleinert haben. Das dafür erforderliche intensivere Licht, können sie aber nur verwenden, weil sie mit einem neuen Trick verhindern, dass die Fluoreszenzfarbstoffe dabei ausbleichen. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1. August, 2006)


Der Blick auf das Innere von Zellen wird immer schärfer: Die beiden Abbildungen zeigen Filamente in einer menschlichen Nervenzelle; links durch ein herkömmliches Konfokalmikroskop, rechts durch ein STED-Mikroskop. Die Auflösung des STED-Mikroskops ist zwölfmal besser. Bild: MPI für biophysikalische Chemie

Wie Viren eine Zelle befallen, wie Nervenzellen Signale weiterleiten oder wie Proteine arbeiten - der Nanokosmos der Natur bleibt dem menschlichen Auge verborgen. Um das scheinbar Unsichtbare dennoch zu beobachten, müssen wir die Objekte vergrößern - zum Beispiel unter einem Fluoreszenzmikroskop. Mit ihm beobachten die Wissenschaftler fluoreszierende Marker, die sie zuvor an Proteine und andere Biomoleküle geheftet hatten. Lange Zeit verhinderte jedoch eine zu geringe Auflösung tiefere Einblicke in die Funktion von Proteinen - einzelne Proteine waren mit ihren 2-20 Nanometer Durchmesser dafür bislang zu klein.

Wissenschaftler des Max-Planck-Instituts für biophysikalische Chemie in Göttingen haben nun mit ihrem STED-Mikroskop (Stimulated Emission Depletion) eine Auflösung von bis zu 15 Nanometer erzielt. Damit ist ihr Fluoreszenzmikroskop zwölfmal schärfer als ein konventionelles. Bereits im April hatten die Forscher um Professor Stefan Hell eine Detailschärfe von bis zu 60 Nanometer in der Zelle erreicht.

Noch vor wenigen Jahren gingen Physiker noch davon aus, dass sie keine Details unterscheiden können, die dichter als 200 nm beieinander liegen. Diese Grenze setzte jedenfalls das Abbe’sche Gesetz, wonach die Auflösung eines Lichtmikroskops nicht genauer sein kann, als die halbe Wellenlänge des eingestrahlten Lichts.

Hell und seine Mitarbeiter haben diese Grenze mit einem Trick überwunden. Sie regen die Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen sie etwa Proteine markiert haben, zunächst mit einem blauen Lichtstrahl an. Den Spot dieses Strahls können sie jedoch nicht schärfer als 200 Nanometer machen - so wie es das Abbe’sche Gesetz vorschreibt. Doch noch ehe die angeregten Moleküle in dem Lichtfleck leuchten, regen sie die Moleküle im äußeren Bereich des Lichtflecks wieder ab. Zu diesem Zweck legen sie einen zweiten ringförmigen Lichtstrahl, den STED-Strahl, über den Anregungsspot. Nur in einem deutlich kleineren Fleck im Zentrum des Lichtrings bleiben die Moleküle angeregt und können anschließend leuchten.

Dabei gilt: je intensiver der STED-Strahl, desto kleiner lässt sich der Kreis ziehen, in dem die Moleküle noch fluoreszieren können. Und umso besser ist die Auflösung. Allerdings bleichen die fluoreszierenden Farbteilchen in einem intensiveren Lichtstrahl auch schneller aus und man sieht - nichts. Die Göttinger Wissenschaftler fanden nun heraus, dass die Fluoreszenzmoleküle meistens ausbleichen, weil sie immer wieder für rund eine Mikrosekunde in einen weiteren, dunklen Zustand - Physiker sprechen von einem Triplett-Zustand - geraten. Wird ein Molekül, das sich gerade in diesem Zustand befindet, von einem Lichtteilchen getroffen, so wird es unwiderruflich geblichen. Sie lösten das Problem, indem sie die Moleküle mit Lichtpulsen bestrahlten, die zwischen jedem Puls 4 Mikrosekunden Abstand lassen. Genug Zeit für die Moleküle, um aus dem dunklen Zustand zurückzukehren. Anschließend stehen die Moleküle wieder für die An- und Abregung zur Verfügung.

"Die STED-Technik ist noch lange nicht ausgereizt", sagt Professor Hell. Denkbar seien Auflösungen auf der Größe eines Farbstoffmoleküls - dies entspräche einer Schärfe von ein bis zwei Nanometern. Die Fluoreszenzmikroskope finden vor allem in der Biologie häufig Anwendung. Ihr Vorteil: sie können das Innere lebender Zellen sichtbar machen, ohne sie dabei zu beschädigen. Mit ihrer STED-Technik haben die Göttinger Wissenschaftler bereits gezeigt, wie sich das Protein Bruchpilot räumlich in Synapsen anordnet und damit die Ausbildung aktiver synapti-scher Zonen auslöst, an denen die Nervenzelle bevorzugt Neurotransmitter ausschüttet. Außerdem erforschten sie, auf welche Weise in Synapsen ausgeschüttete Proteine sich an der präsynaptischen Membran anordnen.

[SH/PH]

Originalveröffentlichung:

Donnert, G., J. Keller, R. Medda, M. A. Andrei, S. O. Rizzoli, R. Lührmann, R. Jahn, C. Eggeling, S. W. Hell (2006)
"Macromolecular-scale resolution in biological fluorescence microscopy"
Proc. Natl. Acad. Soc. USA 130 (31): 11440-11445

Dr. Andreas Trepte | Max-Planck-Gesellschaft
Weitere Informationen:
http://www.mpg.de/

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