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Wie Transfer-RNAs zurechtgeschnitten werden und warum dünne Flüssigkeitsfilme aufbrechen

15.07.2003


Wissenschaftspreis der Stadt Ulm 2003



In allen Lebewesen übersetzen die Transfer-RNAs (tRNAs) die in der DNA in Form des genetischen Codes gespeicherte Information in die Proteine (Eiweiße). Die tRNAs werden zunächst als größere Moleküle (Vorläufer-Moleküle) synthetisiert, aus denen die funktionsfähigen tRNAs erst durch die sogenannte Prozessierung herausgeschnitten werden müssen. Für die Entdeckung der molekularen Schere, die die tRNA am vorderen Ende aus dem Vorläufer herausschneidet, die RNase P, gab es vor mehr als zwanzig Jahren den Nobelpreis. Die Schere für das Herausschneiden am "hinteren Ende", die RNase Z, wurde jahrelang vergeblich gesucht. In der Abteilung Molekulare Botanik (Leiter Prof. Dr. Axel Brennicke) der Universität Ulm konnte diese RNase Z jetzt erstmalig isoliert werden. Ausgehend von der aus Weizenkeimlingen aufgereinigten RNase-Z-Proteinsequenz identifizierten PD Dr. Anita Marchfelder und Mitarbeiter die entsprechenden RNase-Z-Gene in Pflanzen und Archaea. Ähnliche Proteine konnten dann in allen organismischen Reichen gefunden werden: von den urtümlichen Archaea über die Bakterien bis zu den Tieren und Menschen. Interessanterweise gibt es kurze und lange Versionen von diesen Proteinen. Die langen Versionen sind gut doppelt so lang wie die kurzen und treten nur bei den mehrzelligen Organismen, den Eukaryonten auf. Wahrscheinlich sind die langen Proteine im Laufe der Evolution durch Verdopplung der kurzen Proteine entstanden. Das menschliche RNase-Z-Protein wurde in der jüngeren Vergangenheit mit dem Auftreten von Krebs in Zusammenhang gebracht; es kann jetzt über die in Ulm definierte Funktion als RNase Z gezielt untersucht werden.



Dr. Marchfelder und Arbeitsgruppe erforschen diese lebenswichtigen Proteine speziell in Pflanzen und Archaea. Die einzelligen Archaea sind erst 1977 als eigenständiges Organismen-Reich neben den Bakterien und den Eukaryonten definiert worden. Archaea leben vorwiegend an Orten mit Extrembedingungen wie sehr hohen Temperaturen (bis zu 113 °C), sehr hohem Druck und extrem hohen Salzkonzentrationen. Sie werden unter anderem in Salzseen (z.B. dem Toten Meer) und den heißen Quellen des Yellowstone National Parks angetroffen. Bisher war völlig unklar, wie Archaea die tRNA-Enden herstellen. Marchfelder fand jetzt heraus, daß die einzelligen Archaea wie die höheren Organismen die tRNAs ausschließlich mit der RNase Z zurechtschneiden, ganz anders als die anderen Einzeller, die Bakterien. Beispielhaft werden die Details der tRNA-Prozessierung an dem halophilen (salzliebenden) Archaeon Haloferax volcanii untersucht. Anhand seiner RNase Z wollen die Forscher herausfinden, wie dieses Protein bei den hohen intrazellulären Salzkonzentrationen, bei denen normale Eiweiße verklumpen, funktionsfähig bleibt.

In Pflanzen wurden vier verschiedene Gene für die RNase Z gefunden, die für zwei kurze und zwei lange Formen des Proteins kodieren. Dr. Marchfelder untersucht jetzt zusammen mit Dr. Stefan Binder (Abteilung Molekulare Botanik) in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand), wozu die Pflanze vier RNase-Z-Enzyme braucht. Möglichwerweise sind die vier Enzyme in verschiedenen Teilen der Pflanzenzelle aktiv, in Kern, Zytoplasma, Mitochondrium und Chloroplast. Vielleicht agieren die einzelnen Proteine in unterschiedlichen Geweben (Blättern, Blüten, Wurzeln). Auch wäre es denkbar, daß die vier Proteine unterschiedliche Funktionen haben und neben tRNAs andere wichtige RNA-Typen zurechtschneiden.

Bisherige Analysen haben gezeigt, daß Bakterien für die Herstellung des "hinteren" tRNA-Endes keine Schere benutzen. Jedoch wurde in den Bakterien Escherichia coli und Bacillus subtilis ein Protein entdeckt, das der RNase-Z-Schere ähnlich ist. Warum haben Bakterien eine RNase Z? In Zusammenarbeit mit dem European Molecular Biology Laboratory (EMBL Outstation Hamburg) und dem Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, Paris) will Marchfelder die Funktion der bakteriellen Scheren aufklären.

Sowohl in der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) als auch in der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) gibt es nur jeweils eine einzige RNase-Z-Schere, im Gegensatz zu den Pflanzen mit vier RNase-Z-Scheren. Zusammen mit der Abteilung Genetik der Universität Warschau untersucht die Ulmer Gruppe die RNase Z der Bäckerhefe. In diesem Organismus ist es relativ leicht, die genetische Information in der Zelle zu manipulieren, um Details über die biologische Funktion des Enzyms herauszufinden. In Kooperation mit dem Dartmouth College, Hanover, USA, und dem York College, New York, analysieren Marchfelder und Mitarbeiter die Funktion der RNase Z in der Fruchtfliege. Dabei gelang es den Forschern, die Herstellung der RNase Z in Fruchtfliegenzellen fast vollständig zu unterdrücken. Das Resultat war eine Anhäufung von tRNA-Molekülen, die am hinteren Ende nicht geschnitten waren. Diese Ergebnisse zeigen, daß die RNase Z in der Fruchtfliege - wie in Archaea - für das Schneiden des "hinteren" tRNA-Endes essentiell ist.

Mit der Identifizierung der RNase Z auf molekularer Ebene ist der Zugang zu einem bisher ungeklärten grundlegenden Prozeß in der Molekularbiologie möglich geworden.

Zerreißprobe für dünne Polymerfilme

In der Technik ist es nicht selten unerwünscht, daß manche Flüssigkeiten von einer Oberfläche abperlen. Deshalb findet man zum Beispiel in der Gebrauchsanweisung einer Farbe oder eines Klebstoffes den Hinweis, daß die Oberfläche, auf die die Substanz aufgebracht werden soll, staub- und fettfrei sein muß. In manchen Fällen ist es sogar erforderlich, die Unterlage anzuschleifen oder mit einem Haftgrund vorzubehandeln. Ein anderes Beispiel: Die sehr dünne Schmierschicht in der Festplatte eines Computers, die zwischen dem Schreib-/Lese-Kopf und dem Speichermedium liegt, ermöglicht den dauerhaften Betrieb der Festplatte, da sie mechanischen Kontakt verhindert. Oder der Verbrennungsmotor: Die Schmierschicht Zwischen Zylinderwand und Kolben darf selbst bei den hohen für den Verbrennungsvorgang typischen Temperaturen nicht abreißen.

In diesen und zahllosen anderen Fällen ist es von großer Bedeutung zu wissen, warum dünne Flüssigkeitsfilme aufbrechen oder sich "entnetzen", wie es fachsprachlich heißt. Mit diesen Vorgängen hat sich Dr. Ralf Seemann, Abteilung Angewandte Physik (Leiter Prof. Dr. Stephan Hermighaus) der Universität Ulm, auseinandergesetzt. Er untersuchte im Detail, wie ein hauchdünner Film des Kunststoffes Polystyrol von einem glatten Silizium- oder Siliziumoxid-Plättchen abperlt. Gegenüber Wasser ist Polystyrol recht zähflüssig, daher entnetzt sich der Kunststoff langsam. Der Vorgang kann einige Stunden oder sogar Tage dauern. In der dünnen Kunststoffschicht entstehen zunächst kleine Löcher, die sich allmählich vergrößern. Das Polystyrol sammelt sich in den Lochrändern an. Es bilden sich ringförmige Wulste, deren Größe ständig zunimmt. Sind die einzelnen Löcher so weit angewachsen, daß benachbarte Polystyrolränder einander berühren, verschmelzen sie. Von dem ursprünglichen Film bleibt nur ein Netzwerk aus Stegen übrig, die schließlich zu einzelnen Tröpfchen zerfallen.

Welche Bedingungen führen zur Entnetzung? Für das Aufbrechen extrem dünner Polymerfilme, die nur wenige zehn Nanometer dick und damit ungefähr zehntausendmal dünner sind als ein menschliches Haar, ging man bisher von zwei möglichen Ursachen aus: die Löcher bilden sich entweder in der Umgebung von Staubteilchen oder chemischen Verunreinigungen (heterogene Nukleation), oder sie entstehen spontan durch Verstärkung der thermischen Fluktuation der Filmdicke (spinodale Entnetzung).

Seemann hat den gesamten Entnetzungsvorgang vom Aufbrechen der ersten Löcher, über deren Wachstum bis zum Endzustand der Entnetzung detailliert untersucht und unter anderem neue Mechanismen der Lochbildung gefunden sowie neue Erkenntnisse zur Fließfähigkeit (Viskosität) dünner Polystyrolfilme gewonnen. Mit einem Rasterkraftmikroskop, das die Oberfläche mit einer sehr feinen Spitze abtastet, ist es erstmals gelungen, an hauchdünnen flüssigen Polystyrolfilmen, die auf Siliziumoxid-Plättchen aufgebracht waren, den Entnetzungsvorgang in Echtzeit zu beobachten. Aus den charakteristischen Lochabständen und der Zeitskala, auf der das Entnetzungsmuster entsteht, konnten die Viskosität des Flüssigkeitsfilms und die Stärke der Wechselwirkung zwischen dem Polymer und dem Substrat bestimmt werden. Dabei wurde für dünne Polystyrolfilme auf Siliziumoxid-Plättchen der Entnetzungsmechanismus eindeutig als spinodale Entnetzung identifiziert, womit die aus dem Jahr 1974 stammende Theorie von Eli Ruckenstein und Rakesh K. Jain erstmals quantitativ bestätigt werden konnte. Mit dem Wissen über den genauen Aufbrechmechanismus und dessen theoretischer Berechnung können nun sehr präzise Aussagen über die Stabilität von dünnsten Flüssigkeitsfilmen auf festen Unterlagen getroffen werden.

Ein Film, der stabil gegenüber thermischen Fluktuationen ist, kann nicht über den Mechanismus der spinodalen Entnetzung aufbrechen. Er kann nur über die heterogene Nukleation aufreißen. Seemann stieß aber noch auf eine weitere Möglichkeit: die Löcher können auch durch Verspannungen innerhalb des Polymerfilms verursacht werden. Diese Verspannungen sind allen aus Lösung aufgebrachten Polymerfilmen gemein und haben ihre Ursache in der langkettigen Polymergestalt. Ein Polymer ist aus vielen gleichen Einheiten aufgebaut, wobei die Kettenlänge ein Maß der tatsächlichen Länge des Moleküls im gestreckten Zustand ist. Verspannungen in Polystyrolfilmen treten mit steigender Kettenlänge verstärkt auf.

Im weiteren Verlauf der Entnetzung, wenn die Löcher bereits aufgebrochen sind, sammelt sich das Material in einem Randwulst ringförmig um die Löcher an. Aus der charakteristischen Form dieser Lochrandprofile und der Dynamik des Lochwachstumes lassen sich Rückschlüsse auf rheologische Eigenschaften von Polymeren auf kleinster Längenskala ziehen. Für Flüssigkeitsfilme, die sich wie eine ideale Flüssigkeit verhalten, fand Seemann zudem eine bis dahin unbekannte Form des Lochrandes, die unter geeigneten Bedingungen die Bildung von konzentrisch um das ursprüngliche Loch angeordneten Satellitenlöchern nach sich zieht.

Die Analyse des zeitlichen Ablaufs des Aufreißens führte zur Entdeckung einer Viskosität der hauchdünnen Polystyrolfilme, die von derjenigen des kompakten Materials stark abweicht. Die genaue Filmdickenabhängigkeit dieses anomalen Verhaltens konnte mit Hilfe optischer Dilatometrie (Messung der thermischen Ausdehnung) bestätigt und mit einem theoretischen Modell beschrieben werden. Im Vergleich zum Volumenmaterial Polystyrol, das z.B. als Material für Joghurtbecher oder CD-Hüllen begegnet, haben extrem dünne Polystyrolfilme eine millionenfach niedrigere Viskosität mit der Folge extrem höherer Beweglichkeit. Es ist zu erwarten, daß die von Seemann gewonnenen Erkenntnisse zu den Entnetzungsprozessen à la longue zum Beispiel Einfluß auf die Technologie verschiedenster industrieller Beschichtungsprozesse haben werden.

Wissenschaftspreis

PD Dr. Anita Marchfelder und Dr. Ralf Seemann werden für ihre Arbeiten am 21. Juli mit dem Wissenschaftspreis der Stadt Ulm 2003 ausgezeichnet. Dritter Preisträger ist Prof. Dr. Rainer Bucher von der Fachhochschule Ulm für seine Untersuchungen zur "Ultraschalldiagnostik des hirnversorgenden Blutkreislaufs unter dem Aspekt des Schlaganfalls". Der Wissenschaftspreis der Stadt Ulm wird in zweijährigem Turnus verliehen. Er ist mit 15.000 EURO dotiert.

Peter Pietschmann | idw

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