Der HPLC-Tipp im November

Der FallAls HPLC-Anwender weiß man, dass die präzise Herstellung von Eluent und Probenlösung eine elementare Grundvoraussetzung für reproduzierbare Ergebnisse ist. Soweit so gut.

Jetzt ist die Frage, wie stark machen sich denn kleine ungewollte/unbedachte Differenzen wirklich bemerkbar?Die LösungSie können in der Tat sehr viel bewirken! Fangen wir bei der Herstellung des Eluenten an und betrachten zunächst die Normal-Phasen-Chromatographie. Hier ist der Einfluss am stärksten.

So kann es viel ausmachen, ob beispielsweise ein NP-Eluent (z.B. Hexan) abhängig von den Aufbewahrungsbedingungen der Lösungsmittel und der Praxis des Ansetzens 30 oder 60 ppm Wasser enthält, denn: Eine konstante, Gesamtmenge an Wasser in einem NP-System ist die wichtigste Voraussetzung für konstante Retentionszeiten.

Nicht so gravierend – also im ppm-Bereich –, dennoch signifikant ist die Konstanz der Eluenten-Zusammensetzung in der RP-Chromatographie. Merke als Faustregel: Eine Differenz von 1 % B im Eluenten kann bei klassischen RP-Trennungen zu einer Differenz von 4…5 % (oder mehr) im Retentionsfaktor k führen. Generell können sich durch eine etwaige kleine Differenz in der Eluentenzusammensetzung die Retentionszeit, die Empfindlichkeit, die Peakfläche, die Peakform oder die Selektivität ändern, schließlich kann manch ein zusätzlicher Peak erscheinen. Nachfolgend einige Beispiele, wobei neben einer unbeabsichtigten Änderung des Eluenten auch die Rede von sehr kleinen Mengen an Modifier/Kontaminanten die Rede ist:

Es kann etwas ausmachen, ob der Eluent in einem trockenen oder in einem „nassen“ Behältnis angesetzt wird, siehe dazu HPLC-Tipp Juli 2009 (www.novia.de, dort HPLC-Tipps Archiv, oder http://www.labo.de, HPLC-Tipps) – die Retentionszeit ändert sich.Die Peakform oder im Falle von LC-MS-Kopplung auch die Empfindlichkeit kann sich ändern, je nachdem, ob im Eluenten 0,1 oder 0,2 % TFA (Trifluoressigsäure) vorhanden sind.Ebenfalls die Peakform und auch die Selektivität können sich bei der Verwendung einer kleinen Menge eines Ethers ändern, z.B. 0,2…0,4 % THF (Tetrahydrofuran) oder MTBE (tert. Butylmethylether).Bei Temperaturdifferenzen im Labor zwischen morgens und nachmittags kann Lösungsmittel/Eluent im oberen Bereich des Vorratsgefäßes kondensieren, auch hier kann es zu driftenden Retentionszeiten kommen.Ein weiteres Beispiel, in dem wieder indirekt eine Temperaturdifferenz im Spiel ist: Einmal befindet sich das Kölbchen mit der Probenlösung in wenig Wasser im Ultraschallbad (damit es stehen kann…) und einmal im Drahtkörbchen oder in einem Becherglas.

Durch die unterschiedliche Temperaturdifferenz der Probenlösung und der damit verbundenen Volumenabhängigkeit ist ein unterschiedliches Volumen an Lösungsmittel notwendig, um anschließend auf die Marke aufzufüllen. Das Ergebnis sind etwas veränderte Konzentrationen und damit ergeben sich im Falle von konzentrationsabhängigen Detektoren (DAD, UV-Vis, FLD) veränderte Peakflächen.Manch´ einer spült das Vorratsgefäß mit Aceton, damit es schneller trocknet. Das restliche Aceton an den Wänden führt beim UV-Detektor zu einem zusätzlichen Peak.Das FazitAuch Unterschiede/Zusätze von weit unter 1 % können in der HPLC einiges bewirken. Trivial, dennoch eminent: In der Routine ist eine konstante, sture Arbeitsweise ein Muss.

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