FLAM-Seq: Das ganze Bild der Boten-RNA und ihrer Enden

Forscherinnen und Forscher des Berliner Instituts für Medizinische Systembiologie (BIMSB) des MDC haben ein Werkzeug entwickelt, das erstmals eine genaue Sequenzierung der Boten-RNA zusammen mit ihren Endstücken ermöglicht. Professor Nikolaus Rajewsky und sein Team haben dieses neue Werkzeug, die Full Length Poly(A) und mRNA-Sequenzierung, kurz „FLAM-seq“, kürzlich in der Fachzeitschrift Nature Methods beschrieben.

Boten-RNA (mRNA) ist äußerst wichtig, da sie Anweisungen aus der DNA in Proteine übersetzt, die wiederum jeweils bestimmte Aufgaben erfüllen. In jeder Zelle befinden sich Hunderttausende mRNA-Moleküle, die Proteine erzeugen. Die meisten von ihnen weisen ein „Poly(A)-Endstück“ auf – eine Reihe von Adenosinen, die As der grundlegenden RNA-Bausteine A, G, U und C. Die Wissenschaft will den Einfluss der Endstücke auf die mRNA- und auf die Proteinproduktion verstehen.

„Das ist äußerst wichtig, da fast alle mRNAs mit einem Poly(A)-Endstück ausgestattet sind. Warum ist das so?“, fragt Dr. Ivano Legnini, Postdoktorand im MDC-Labor für Systembiologie genregulatorischer Elemente und einer der Erstautoren der Studie. „Das ist ein Schlüssel zum Verständnis der Genregulation; und das ist der Prozess, der jeder unserer Zellen ihre Identität gibt.“

Das volle Programm

Forscherinnen und Forscher sind davon überzeugt, dass die Länge der Poly(A)-Endstücke eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Genexpression spielt. Je länger das Endstück ist, desto mehr Proteine produziert die mRNA, vermutete man viele Jahre lang. In jüngster Zeit konnte jedoch gezeigt werden, dass die Korrelation in einigen Systemen oder Entwicklungsstufen zutrifft, nicht aber generell.

Mit dem Fortschritt in den Sequenzierungstechnologien konnte die Forschung die Länge der Poly(A)-Endstücke abschätzen und eine Vorstellung davon bekommen, zu welchen Genen sie gehören. Aber es gab immer noch keine vollständigen Sequenzen der mRNA oder ihrer Endstücke.

Erst in den letzten Jahren wurden neue Sequenzierer entwickelt, die ganze Moleküle mit Tausenden von Nukleotiden sequenzieren können. Das MDC-Team um Nikolaus Rajewsky, dem Leiter des Labors für Systembiologie genregulatorischer Elemente und wissenschaftlichen Direktor des BIMSB, interessierte, ob sie mit dieser neuen Technologie die gesamte mRNA mit ihrem Endstück sequenzieren können. Dazu mussten sie zunächst eine „cDNA-Bibliothek“ vorbereiten – die komplementäre DNA oder das DNA-Äquivalent der mRNA und ihrem Endstück.

Das klang einfach. Aber es dauerte fast sechs Monate, bis das Team ein Protokoll entwickelt hatte, um die gesamte mRNA und ihr Endstück in einen einzelnen DNA-Strang zu kopieren. Aufbauend auf der Expertise der technischen Assistentin Salah Ayoub verbesserte das Team den Vorbereitungsprozess mit verschiedenen chemischen Werkzeugen, bis es die optimale Rezeptur fand. Entscheidend war, dass die Forscherinnen und Forscher auch Gs und Is zu den As hinzufügten. Das erlaubte ihnen, das gesamte Poly(A)-Endstück zu kopieren. „Wir haben die Endstücke verfolgt“, sagte Legnini.

Extrem genau

Ihre DNA-Bibliothek wurde durch einen PacBio-Sequenzierer geschleust, der komplette Sequenzen von Einzelmolekülen erzeugt. Auf der computergestützten Seite des Labors analysierte Dr. Nikos Karaiskos die langen Buchstabenfolgen G, T, A und C und testete sie auf ihre Genauigkeit – mit Proben, bei denen die Anzahl von As bekannt war, und indem er die Ergebnisse mit anderen Sequenzierungsmethoden und Datensätzen verglich. Die Resultate zeigten, dass FLAM-Seq extrem genau ist.

Die Forscherinnen und Forscher prüften die Methode mit uterschiedlichsten Gewebearten – menschlichen Krebszellen, Gehirnzellen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen hergestellt wurden, Wurmzellen. Mit allen haben sie ähnlich gute Ergebnisse erzielt. Das zeigt, dass das Protokoll für jede biologische Probe funktioniert.

„Wir sind wirklich in der Lage, die komplette mRNA in nur einem Anlauf zu untersuchen. Und zwar ohne dass wir dafür aufwendig berechnen müssen, wie die Fragmente zusammengesetzt werden, um eine Vorstellung von der gesamten mRNA in der Zelle zu bekommen“, sagte Jonathan Alles, einer der Erstautoren aus dem Labor von Rajewsky.

Nicht alle sind As

Die erste Analyse offenbarte einige interessante Einblicke. Die Endstücke bestehen nicht alle aus As. Bereits frühere Forschungen hatten gezeigt, dass die äußersten Spitzen der Endstücke neben As auch andere Nukleotide enthielten, aber die überwiegende Mehrheit der Endstücke war zuvor unzugänglich gewesen. Mit FLAM-seq beobachtete das BIMSB-Team nun, dass es weitaus mehr Stellen in den Endstücken gibt, an denen die As durch Cytidine (Cs) ersetzt werden.

Ein weiterer Befund ist, dass die Endstücke verschiedener mRNAs, auch wenn sie vom gleichen Gen produziert werden, eine sehr unterschiedliche Länge haben können. Manche sind etwa 30 Nukleotide lang, andere mehrere hundert. Aber wenn die Länge nicht mit dem Niveau der Proteinproduktion korreliert, wie bisher angenommen, wozu gibt es dann so dramatisch unterschiedliche Längen?

„Die Evolution hat diese Prozesse seit Millionen von Jahren geprägt, ich kann nicht glauben, dass dies nur Zufall ist“, sagte Legnini. „Es muss einen Grund geben, warum mRNA mit unterschiedlich langen Endstücken ausgestattet ist.“

Nun, da das Werkzeug entwickelt, erprobt und zum Patent angemeldet wurde, könne das wahre Vergnügen beginnen, sagte Legnini. Mit FLAM-Seq können jetzt spezifische Fragen untersucht werden.

„Wir wissen, dass die Genexpression durch das Zusammenspiel verschiedener Prozesse, nämlich Transkription, Spleißen und Tailing, reguliert wird“, sagte Rajewsky. „Ich bin sehr glücklich über FLAM-seq. Es ermöglicht es uns, diesem Gespräch direkt zuzuhören und wird uns so helfen, das Zusammenspiel zu verstehen.“

Die Gruppe teilte die Methode auf der Plattform Protocol Exchange und ermutigt andere Labore, sie auszuprobieren.

AG Rajewsky
Beschreibung der Methode auf Protocol Exchange
Literatur
Ivano Legnini, Jonathan Alles et al. (2019): „FLAM-seq: full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control“.

Nature Methods, https://doi.org/10.1038/s41592-019-0503-y