Einzelne Zellen handhaben und detektieren für den Hochdurchsatz

Isolierung von Zellen in einer Multititerplatte: Das Prinzip dabei lautet: »one cell one well«. Fraunhofer IPA, Rainer Bez

Viele Erkrankungen werden durch einzelne Zellen bewirkt. Zirkulieren in der Blut- oder Lymphlaufbahn beispielsweise Tumorzellen, können Tumore entstehen oder sich Metastasen im Körper bilden. Dieses Wissen aus der Einzelzellanalytik der Lebenswissenschaften soll zukünftig als diagnostisches Werkzeug oder zur Entwicklung sehr spezifisch wirkender Arzneimittel genutzt werden.

Gelingt die Isolation und eine Vorselektion auf eine überschaubare Anzahl einzelner Zellen, so können die existierenden Werkzeuge zur Analyse des Genoms, Transkriptoms und Proteoms auf diese Zellen angewendet werden. Was in der »defekten« Zelle abläuft und welche Effekte der Defekt hervorruft, können dadurch entdeckt und Maßnahmen, wie diese Defekte am besten therapiert werden, abgeleitet werden.

Außer für Diagnose und Therapie von Krankheiten sind die Einzelzellhandhabung und Einzelzellablage wichtige Werkzeuge in der Produktion vieler Medikamente. Heute auf den Markt kommende Arzneimittel werden zunehmend biotechnologisch produziert. Alle dort eingesetzten Zellen sind Klone, die auf eine einzelne Zelle zurückgehen. Die Identifikation dieser »Ursprungszelle« erfolgt in einem vorgelagerten aufwendigen Entwicklungsschritt, in der die optimal produzierende Zelle aus einer riesigen Zellkohorte isoliert, abgelegt und anschließend weiter kultiviert wird.

Es sind bereits verschiedene Methoden zur Isolierung und Handhabung von Einzelzellen am Markt etabliert. Alle zeichnen sich durch hohe Kosten oder durch einen begrenzten Durchsatz aus. Wissenschaftler haben die am Fraunhofer IPA entwickelte, bereits etablierte I-DOT-Technologie (immediate-drop-on-demand-Technology) weiterentwickelt und aufgerüstet.

Das neue Werkzeug zur Einzelzellhandhabung und Selektion »FASCINATE« (Fluorescence Activated Single Cell Isolation using Nanodroplet Technologies) besteht aus Gerätemodulen einer zellschonenden Dosierung einzelner Zellen in einzelnen Tropfen, einer Detektionseinheit zur Identifizierung von Einzelzelltropfen sowie einer Analytik zur spezifischeren Charakterisierung einer Einzelzelle im Tropfen.

Handhabung setzt gleichmäßige Verteilung der Zellen voraus

Die Handhabung von Zellen, insbesondere Einzelzellen, stellt enorme Herausforderungen an die eingesetzten Werkzeuge. Die Handhabung muss zum einen steril erfolgen, während der gesamten Prozessschritte darf keine Kontamination mit Fremdzellen auftreten. Zum anderen müssen die physikalischen Einflüsse verstanden und kontrolliert sein, da zum Beispiel zu hohe Scherkräfte zu einem Absterben der Zellen führen können.

Eine wichtige Voraussetzung für die erfolgreiche Zellvereinzelung ist die homogene Verteilung der Zellen im Ausgangsgefäß, um diese homogen und letztendlich vereinzelt aus diesem dosieren zu können – eine große Herausforderung für viele Zellarten. Der Grund: Zellen sedimentieren als Partikel und viele Zellarten neigen dazu, zu verklumpen, was diesen Vorgang noch verstärkt. Im Extremfall kann dies zu einer Verstopfung des eingesetzten Dosier- oder Pipettiertools führen.

Dispensiergerät mit hohem Zelldurchsatz

Für viele der oben beschriebenen Anwendungsfälle, vor allem in der Produktion von Arzneimitteln, liegen sehr großen Zellzahlen vor. Hier muss die Isolierung und Einzelzellablage in einer sehr hohen Vereinzelungsrate und im Idealfall parallelisiert durchgeführt werden. Der I-DOT bietet die idealen Voraussetzungen dafür, da er bis zu acht Tropfen im Nanoliterbereich gleichzeitig dosieren kann.

Vier Einzeltechnologien für eine ganzheitliche Zellvereinzelungs-, Dosier- und Detektionseinheit

Zur Umsetzung von FASCINATE wurden vier Technologien entwickelt, die Resuspendier-, Dosier-, Zelldetektions- und die Auswerteeinheit. In der sogenannten Resuspendiereinheit wird das Stoffgemisch wiederholt aufgemischt, um eine effektive Zellvereinzelung zu gewährleisten. Das patentierte Resuspendierverfahren besteht aus einer Pipettiernadel, die durch wiederholtes Aufsaugen und Auspipettieren der Zellsuspension an der Nadelspitze definierte und sehr geringe Scherspannungen erzeugt. Der eigentliche Dosiervorgang muss so erfolgen, dass auch hier möglichst geringe mechanische und fluidische Störkräfte auf die Zellen einwirken, die Zellschäden verursachen könnten.

Hierfür wurde eine angepasste Düsengeometrie mit größeren Kapillardurchmessern und abgerundeten Kanten entwickelt. Die Hauptinnovation besteht in einem Detektionsmodul, das einzelne Zellen im Tropfen messen kann. Zu diesem Zweck werden spezifische Zellen mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt. Über einen Laser mit einer spezifischen Anregungswellenlänge und einer spezifischen Detektionseinheit können dann die Zellen identifiziert werden. Die aufgenommenen Signale werden abschließend in Echtzeit ausgewertet, um leere Tropfen und Tropfen mit einer oder mehreren Zellen voneinander unterscheiden zu können.

Die aufgeführten Technologien wurden in einem ersten Versuchsstand getestet und werden nun als erste Anwendung in den I-DOT integriert, um dieses grundsätzliche Dosierprinzip in ein schnelles effizientes Zellsortierungs- und Handhabungssystem zu erweitern. Darüber hinaus sind alle Einzeltechnologien aber auch in anderen Dosierverfahren einsetzbar.

Fachlicher Ansprechpartner: Michael Klinger, Telefon +49 711 970-1627, michael.klinger@ipa.fraunhofer.de

http://www.ipa.fraunhofer.de/innovationspreis_2016.html

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Jörg Walz Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung IPA

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