Online-SPE-Technik

Um Laborkosten zu reduzieren und die Produktivität zu steigern, wächst aktuell die Nachfrage nach automatischer Probenvorbehandlung. In Umweltlabors ist die Spurenanreicherung eine der aufwändigsten Aufgaben, zu denen etwa die Flüssig-Flüssig-Extraktionen (LLE) zählt oder die Aufreinigung und Rückkonzentrierung durch Lösungsmittelverdampfung. In vielen Fällen hat die Festphasenextraktion (SPE) die LLE erfolgreich ersetzt.

Die Online-SPE braucht weniger Lösungsmittel und hat einen zusätzlichen Vorteil: Sie verzichtet darauf, ein Extraktionsmittel zu verdampfen, was vorteilhaft ist für das gesamte Wiederfinden von Zielsubstanzen. Zudem werden alle Zielverbindungen nachgewiesen. Im Falle einer Offline-Vorbehandlung wird stets ein Aliquot des erhaltenen Extrakts in ein Analysensystem injiziert.

Eine andere Entwicklung betrifft den ansteigenden Durchsatz. In vielen Fällen ist die Geschwindigkeit der Schlüsselfaktor. In der Umweltanalytik sind die Proben jedoch ziemlich komplex. Auch wenn Substanzen mit selektiveren Methoden (z.B. Fluoreszenznachweis) detektiert werden, ist noch ausreichend Trennleistung notwendig, um alle gefundenen Verbindungen aufzutrennen und so falsche Positivergebnisse verhindern.

In einigen Fällen lassen sich mit einem zweiten Detektorsystem falsch-positive Ergebnisse ausschließen oder zumindest abschwächen. Manchmal wird auch eine schnelle Analysentechnik für ein Screening eingesetzt. Sobald sich ein positives Ergebnis abzeichnet, muss es durch ein zweites Analysenverfahren bestätigt werden. Wie oben im Zusammenhang mit der Umweltanalytik dargelegt, erweisen sich die Proben als sehr komplex, so dass sich nur Methoden mit äußerst selektiven Nachweistechniken (z.B. LCMS/MS oder GCMS) für ein Screening einsetzen lassen.

Online-SPE-Technik für PAH-Bestimmung
Shimadzu Benelux hat zusammen mit Vitens, dem größten Trinkwasserversorger der Niederlande, eine Online-SPE-Technik entwickelt, die polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH) in Trinkwasser, Grund und Oberflächenwasser bestimmt. Vitens liefert jährlich etwa 350 Millionen m3 Trinkwasser für etwa ein Drittel des Landes. Das Unternehmen unterstützt auch Trinkwasserhersteller in Afrika, Südamerika und Asien in der Verbesserung ihrer Wasserversorgung und sanitären Einrichtungen.

Eine Analyse von polyzyklischen Kohlenwasserstoffen wird in erster Linie mit einer HPLC mit UV- oder Fluoreszenzdetektion oder mit einer GCMS durchgeführt, wobei die beiden letztgenannten breiter akzeptiert sind. Im hier dargestellten Fall bestand das Ziel darin, eine SPE und eine HPLC-Technik mit Fluoreszenznachweis zu kombinieren.

Als Ausgangspunkt wurde die HPLC-Technik zur vollständigen Trennung von 16 [1] PAHs mit EPA-Vorrang gewählt. Die Methode basiert auf einem binären Wasser-Acetonitril-Hochruckgradienten unter Verwendung einer C18-Reversed-Phase-Säule. Durch Absenkung der Säulentemperatur auf 20 °C und Reduzieren der Gradientensteigung von 25 auf 100 % Acetonitril in 30 Minuten wurde die Trennleistung weiter verbessert. Die Minimal-Auflösung zwischen dem kritischen Paar (Acenaphthylen und Fluoren) betrug etwa 3,4. Die niedrige Säulentemperatur führt zu einer Maximal-Auflösung für PAH-Verbindungen, was ein einfaches Umschalten von Anregungs- und Emissionswellenlängen im RF-20Axs-Fluoreszenzdetektor gestattet.

Nachdem Methodenstabilität hergestellt war, wurde das HPLC-System weiter auf Online-SPE-Eigenschaften erweitert. Dazu wurden die SPE-Kartusche, eine Pumpe mit 4–fach Lösemittelauswahlventil zum Reinigen, Konditionieren und Spülen des C8-SPE-Materials sowie zwei 6-Port-2-Positions-Ventile hinzugefügt. In dieser Phase wurde die Entgasungskapazität erhöht und auch der Autoinjektor durch den präparativen SIL-10AP-Injektor ersetzt, da dieser für größere Injektionsvolumina besser geeignet ist.

Vor der Beladung mit einer Probe wurde die SPE-Kartusche zunächst mit Acetonitril gesäubert, mit Methanol konditioniert und mit Wasser gespült. 4 ml Probevolumen [2] wurden injiziert und mit einem Fluss von 1 ml/min einer Acetonitril-Wasser-Mischung auf die SPE-Kartusche überführt. PAH-Verbindungen neigen dazu, sich überall in der Flusslinie anzuhaften. Daher wird eine 33-%ige Acetonitril-Lösung benötigt, um dieses Problem zu umgehen. Nach Beladung mit einer Probe wurde die Kartusche erneut mit Wasser gespült, bevor die Verbindungen mit 100 % Acetonitril eluiert wurden. Der aus der SPE-Kartusche kommende Volumenfluss wurde nachgeschaltet mit Wasser gemischt, um den Wasser-Acetonitril-Gradienten zur PAH-Trennung in der Analysensäule zu erzeugen.

Analysenbedingungen
Säule: Pursuit PAH3 4,6 mm i x 100 mm l, 3 µm.Vorsäule: ChromSep Guard, Pursuit PAH 3 x 10 mm l.Mobile Phase: A Wasser/B Acetonitril.Gradient: B: 25 % –> 100 % (30 min).Flussrate: 1,0 ml/min.Temperatur: 20 °C.Detektion: Fluoreszenz (siehe Tabelle).Injektionsvolumen: 4 ml.SPE-Säule: HySpere Resin SH 25, 2 x 10 mm l.Durchfluss: 1 ml/min Wasser-Acetonitril 7/3 (v/v).
Die Quantifizierungsgrenze (LOQ) liegt je nach Matrix zwischen 0,0007 und 0,0059 µg/l, mit Ausnahme von Naphthalen (0,0087…0,021 µg/l). Das LOQ wird errechnet als das Dreifache der Standardabweichung nach einer Zugabe von 0,01 µg/l, welche an acht unabhängigen Tagen bestimmt wurde. Die Wiederholgenauigkeit liegt zwischen 0,39 und 6,4 % (n = 8), die Reproduzierbarkeit liegt im Bereich von 1,3…9,9 % (n = 8).

Der Einsatz des RF-20Axs, des weltweit wohl sensitivsten HPLC-Fluoreszenzdetektors, erfüllt die Anforderungen insbesondere für hochempfindliche Umweltanalysen.

Nachdruck aus Shimadzu News 1/2011
Anmerkungen[1] Alle 16 EPA-PAH lassen sich mit einem UV-Detektor nachweisen. Mit einem Fluoreszenznachweis konnten nur 15 der 16 EPA-PAH analysiert werden, da Acenaphthylen keine intrinsische Fluoreszenz generiert.

Die Probe wurde vor der Injektion in einem Probenfläschchen mit Acetonitril gemischt.

Shimadzu Benelux, E-Mail: shimadzu@shimadzu.eu, http://www.shimadzu.eu