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Monolithische HPLC-Säulen

01.01.2009
Schneller, empfindlicher und kostengünstiger

Monolithische HPLC-Säulen bestehen aus einem hochporösen Kieselgelstab, welcher gleichzeitig hohe Permeabilitäten und Trennleistungen besitzt. Mit ihnen können auch komplexe Substanzmischungen in wenigen Minuten effizient und kostengünstig analysiert werden.

Einleitung

Die HPLC (High Performance Liquid Chromatography) hat sich als Routinemethode zur Analyse von komplexen Substanzgemischen in unterschiedlichen Arbeitsgebieten wie z.B in der Pharma- und klinischen Chemie oder auch in der Lebens- und Umweltchemie etabliert. Hierzu haben vor allem die Trennleistung der Methode und ihre Automatisierungsmöglichkeiten geführt. Das Herzstück in der HPLC ist die Trennsäule, auf welcher die einzelnen Komponenten einer Mischung getrennt werden. Herkömmliche Säulen bestehen üblicherweise aus Kieselgelpartikeln, deren Größe die Trennleistung einer Säule bestimmen. HPLC-Säulen mit kleinen Partikeln in der Größenordnung 1,7...2,5 µm machen zurzeit Furore, da sie hohe Trennleistungen besitzen. Allerdings haben sie auch etliche Nachteile:
Sie besitzen geringe Permeabilitäten und hohe Säulenrückdrücke, welche mit speziellen und teuren UHPLC-(Ultra High Pressure Liquid Chromatography-)Anlagen überwunden werden müssen;Sie neigen leicht zu Verstopfungen bei matrixbelasteten Substanzproben wegen des geringen Zwischenkornvolumens und der verwendeten Fritten mit sub-µm-Porendurchmesser;Sie besitzen geringere Standzeiten durch Änderung der Säulen-(Partikel-)Packung bei permanentem Einfluss hoher Drücke (zwischen 600...1000 bar).

Eine geeignete Alternative zu diesen partikulären Säulen bieten monolithische HPLC-Säulen (Bild 1). Sie bestehen aus einem porösen Kieselgelstab, welcher mit einem maßgeschneiderten bimodalen Porensystem ausgestattet ist. Makroporen mit einer Größe von 1,5...2 µm unterbrechen das Kieselgelnetzwerk(-skelett) und geben den Säulen eine hohe Permeabilität und niedrige Säulenrückdrücke (Bild 2). Mesoporen in der Größe von 11...13 nm befinden sich auf und in dem Kieselgelskelett und verleihen den Kieselgelstäben hohe Oberflächen, welche für einen effizienten chromatographischen Trennprozess notwendig sind.

Monolithische HPLC-Säulen

Monolithische HPLC-Säulen sind als Chromolith® Säulen kommerziell erhältlich (Merck KGaA, VWR International GmbH). Die erste Säule dieser Art wurde mit einer Dimension von 100-4,6 mm im Jahre 2000 auf dem Markt eingeführt. Die Chromolith® Performance RP-18e besitzt einen Säulenrückdruck vergleichbar zu einer partikulären Säule gefüllt mit 11-µm-Partikeln und eine Trennleistung vergleichbar zu einer partikulären Säule gefüllt mit 3,5-µm-Partikeln. Monolithische HPLC-Säulen vereinen also gleichzeitig eine hohe Permeabiltät und Trennleistung. Dieses schließt sich bei partikulären Säulen aus. Die Gesamtporosität der Monolithen beträgt ca. 85 %, wobei Dreiviertel dieser Porosität von den Makroporen herrührt. Insgesamt besitzen diese Säulen infolge ihrer hohen Porosität eine geringere Kapazität, weshalb die zu trennenden Substanzen bei gleichen Flussraten (im Vergleich zu partikulären Säulen) schneller getrennt werden. Ein Beispiel hierfür ist auf Bild 3 zu sehen. Hier wurde eine Substanzmischung von 5 Komponenten (Toluol, Biphenyl-2ol, Progesteron, Hexanophenon und Anthracen) unter vergleichbaren chromatographischen Bedingungen getrennt und zwar auf einer partikulären Säule der Dimension 50-2.1 mm gefüllt mit 1,7-µm-Partikeln (Aquity BEH C18 für UPLC) in 2,5 min und einer monolithischen Säule der Dimension 50-2 mm (Chromolith® FastGradient) in 1,75 min.
Monolithische HPLC-Säulen können mit konventionellen, "low pressure" HPLC-Geräten betrieben werden. Daneben lassen sie sich auch an UHPLC-Geräte betreiben. Die monolithischen HPLC-Säulen sind mit einem lösungsmittelresistenten und mechanisch stabilen Polymer (PEEK) ummantelt und bis zu einem Säulenrückdruck von 200 bar stabil. Dieser Säulenrückdruck wird auf einer Chromolith® Performance RP-18e Säule der Dimension 100-4,6 mm mit einem Fluss von ca. 9 ml/min unter Verwendung von Acetonitril/Wasser-Gemischen erhalten. Grundsätzlich können bei diesen hohen Flussraten schnelle Trennungen erzielt werden. Allerdings hat der Trend zu Lösungsmitteleinsparungen vor dem Hintergrund der laufenden Wirtschaftsrezession zu neuer Aktualität geführt. Lösungsmittel, die als Nebenprodukte bei großen Industrieprozessen anfallen, werden in Zukunft deutlich knapper und teurer werden, da die besagten Prozesse momentan gedrosselt werden. Aus diesem Grunde werden Prozesse und Methoden benötigt, die weniger Lösungsmittel, vor allem weniger Acetonitril, konsumieren.

Die HPLC arbeitet mit mobilen Phasen und benötigt daher große Mengen an Lösungsmittel. Ein Weg zur drastischen Einsparung von Lösungsmitteln führt zu dem Gebrauch von HPLC-Säulen mit kleineren Durchmessern. Eine monolithische HPLC-Säule mit einem Durchmesser von 2 bzw. 3 mm benötigt zum Beispiel im Vergleich zu einer 4,6-mm-Säule 84.5 % bzw. 57,5 % weniger mobile Phase (Rechenbeispiel in Tabelle). Hier liegt ein enormes Kosten-Einsparungspotenzial vor, welches zurzeit noch sehr wenig genutzt wird. Bild 4 zeigt die chromatographische Trennung von 4 Biphenolen unter Verwendung eines Eluenten bestehend aus Acetonitril/Wasser in der Zusammensetzung 60/40 (V/V). Die Substanzmischung wird unter Verwendung dieses Eluenten auf einer monolithischen Säule mit 4,6 mm Innendurchmesser und einer Flussrate von 4 ml/min in weniger als 2 min getrennt. Dieselbe Trennung kann mit einer monolithischen Säule mit 3 mm Innendurchmesser in der gleichen Zeit erzielt werden, allerdings mit einer reduzierten Flussrate von 1,7 ml/min. Insgesamt werden also 2,3 ml Eluent (= 57,5 %) bzw. Acetonitril eingespart. Zusätzlich zu der Lösungsmitteleinsparung besitzt die monolithische Säule mit 3 mm Durchmesser auch noch eine um den Faktor f = 2,35 höhere Empfindlichkeit [f = (4,6 mm/3 mm)2], welches im Chromatogramm durch die größere Peakhöhe zu beobachten ist.

Schnelle Trennungen von anabolen Steroiden

Anabole Steroide sind weit verbreitete Wirkstoffe, die zum Muskelaufbau und zur Leistungssteigerung, insbesondere im Zusammenhang mit Sportereignissen, eingenommen werden. Desweitern setzt man sie auch vermehrt in der Tierzucht zum schnellen Aufbau von Muskelmasse ein. Insofern benötigt man heutzutage Analysenmethoden, die einen schnellen und gleichzeitig empfindlichen Nachweis dieser Stoffe erlauben. Monolithische Säulen mit einem Innendurchmesser von 2 mm besitzen eine um den Faktor f = 5,3 höhere Empfindlichkeit gegenüber einer 4,6-mm-Säule [f = (4,6 mm/2 mm)2]. Für den Nachweis von Spuren dieser Substanzen sollte daher in jedem Fall mit den 2-mm-Säulen gearbeitet werden. Bild 5 zeigt die Trennung von 11 Steroiden unter Verwendung einer monolithischen Säule der Dimension 50 x 2 mm (Chromolith® FastGradient) in einer Zeit von 2,15 min. Die chromatographischen Bedingungen wurden bezüglich Geschwindigkeit für die dargestellte Trennung optimiert. Hierzu wurde ein Lösungsmittel-Gradient bei erhöhter Temperatur (bei 40 °C) ausgearbeitet. Desweiteren wurde noch die Flussrate innerhalb des Chromatographielaufs von 0,35 ml/min auf 1,5 ml/min erhöht. Die erhöhte Flussrate am Ende des Laufs ermöglicht auch schnellere Reequilibrierungszeiten, was eine zusätzliche Zeitersparnis bedeutet.

Wegen des kleinen Durchmessers kann diese Säule auch in idealer Weise an ein LC/MS-System gekoppelt werden, welches noch mehr Informationen zur Identifikation der nachzuweisenden Substanzen liefert als einfache HPLC-Systeme mit UV-Detektion. Üblicherweise werden die Säulen bei Anbindung an ein MS-Gerät mit kleinen Flussraten Fazit

Monolithische HPLC-Säulen stellen eine Alternative zu den konventionellen HPLC-Säulen dar. Sie vereinen hohe Trennleistungen und Permeabilität und können mit konventionellen wie auch mit UHPLC-Geräten betrieben werden. Monolithische HPLC-Säulen mit kleineren Durchmessern zeigen eine deutlich höhere Empfindlichkeit. Sie werden mit kleinen Flussraten betrieben, was zu Lösungsmitteleinsparungen von bis zu 84,5 % führen kann bei Verwendung von 2-mm-ID-Säulen im Vergleich zu 4,6-mm-ID-Säulen. Monolithische HPLC-Säulen besitzen infolge ihrer hohen Porosität geringere Kapazitäten, was zu verkürzten Retentionszeiten und schließlich zu schnelleren Trennungen führt. Zusammengefasst lässt sich festhalten, dass die Verwendung von monolithischen HPLC-Säulen zu schnelleren und empfindlicheren Analysen führt. Zudem bieten die monolithischen HPLC-Säulen mit kleineren Durchmessern (wie z.B. 2 mm) eine deutliche Reduktion von Lösungsmitteln und somit ein großes Potenzial zur Einsparung von Kosten.

Literatur
[1.] K. Cabrera, G. Wieland, D. Lubda, K. Nakanishi, N. Soga, H. Minakuchi, K.K. Unger, TrAC 1998, 17(1), 50-53.
[2.] K. Cabrera, D. Lubda, H.-M. Eggenweiler, H. Minakuchi, K. Nakanishi, J. High Resol. Chromatogr. 2000, 23(1), 93-99.
[3.] K. Cabrera, J. Sep. Sci 2004, 27, 843-852.
[4.] S. Altmaier, K. Cabrera, J. Sep. Sci 2008, 31, 2551-2559.
Merck KGaA
Frankfurter Straße 250
64293 Darmstadt
VWR International GmbH
Hilpertstraße 20a
64295 Darmstadt

Dr. Karin Cabrera | Hoppenstedt

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